PCR的基本原理

更新時間：2023-06-15

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1概述
聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，縮寫：PCR，又稱多聚酶鏈式反應)，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。

2 PCR原理
PCR技術的基本原理首先基于DNA半保留復制原理，還有堿基互補配對原則，即復制的過程中雙鏈DNA會解鏈，由雙鏈變成單鏈，溫度一般為95℃；之后溫度降下來，引物會結合到DNA單鏈上，在DNA聚合酶的作用下，把游離的dNTP按照堿基互補配對原則結合到單鏈上，形成一條由舊鏈和新鏈雜合成的新的雙鏈DNA。這個過程可概括為‘變性-退火-延伸’三個基本步驟。

一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

變性：利用高溫（94℃～98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1～2分鐘，接下來機器就控制溫度進入循環階段。

退火（又稱復性、降溫貼合、緩冷配對、引物黏合）：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1～2分鐘。新技術的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高于熔點3~5℃，僅需時間5~10秒。

延伸：DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000 bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會比較慢。

3 PCR反應體系表1 標準的PCR反應體系

組分	用量
10×擴增緩沖液	10μl
4種dNTP混合物	200μl
引物	10～100μl
模板DNA	0.1～2μg
Taq DNA聚合酶	2.5 μl
Mg2+	1.5mmol/L
加雙蒸水	100 μl

4 PCR反應特點

4.1特異性強
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10^-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10^-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
4.3簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，經過變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

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