一、凝膠成像分析系統的組成 凝膠成像系統的基本組成包含:CCD相機、鏡頭、暗室和分析軟件。不過其功能不僅于對瓊脂糖凝膠進行成像,現在的成像儀趨向于多功能化,還適用于蛋白膠、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸、印跡膜和菌落平板等應用。在Western Blot方面,高性能的化學發光成像系統能與膠片媲美。 二、CCD CCD是電荷耦合器件(Charge Coupled Device)的英文名稱縮寫,是一種光電轉換器件。是凝膠成像系統的核心部件。絕大多數對數碼相機都有一定的了解,不少人還是這方面的專家。有人把數碼相機的像素看得很重,但比較之后發現,有些400萬、500萬像素的相機拍出來的片子沒有300像素的機子拍出來的好,這是為什么?其實,影響成像的因素很多,衡量CCD好壞的指標,有分辨率,CCD尺寸,動態范圍,靈敏度,量子效率,信噪比等,其中像素數以及CCD尺寸是重要的指標。其實是說感光器件的面積大小,這里就包括了CCD感光器件的面積越大,也即CCD面積越大,捕獲的光子越多,感光性能越好,信噪比越低。 為了方便您更了解CCD的大小,現列舉目前市場上所應用的CCD規格如下: 1英寸——靶面尺寸為寬12.7mm*高9.6mm,對角線16mm. 2/3英寸——靶面尺寸為寬8.8mm*高6.6mm,對角線11mm. 1/2英寸——靶面尺寸為寬6.4mm*高4.8mm,對角線8mm. 1/3英寸——靶面尺寸為寬4.8mm*高3.6mm,對角線6mm. 1/4英寸——靶面尺寸為寬3.2mm*高2.4mm,對角線4mm. 三、制冷CCD 相同滿井電子的CCD,降低CCD噪音,就能提高CCD的檢測能力,熱或者暗電流對于CCD都是噪音,噪音在Cool CCD基本都可以被深度致冷的Peltier消除。在曝光*過5-10秒,CCD芯片就會發熱,沒有制冷設備的芯片,“熱”或者白的像素點就會遮蓋圖像,圖像到處可見雪花。CCD結構設計、數字化的方法等都會影響噪音的產生。當然通過改善結構、優化方法,同樣能減少噪音的產生。 制冷CCD的適用性:熒光及化學發光本身較弱,所以對CCD噪音的降低要求很高,應選用高分辨率數字制冷CCD相機結合高通透鏡頭系統,使其能夠捕獲到信號極其微弱的熒光及化學發光樣品圖像,并且能夠較為大程度的降低噪音,減少背景,提供出色的圖像清晰度。另外可選激發光源及多位濾鏡輪擴大了熒光/化學發光成像的應用范圍。所以一般在熒光及化學發光觀察時需要選擇制冷CCD。所以制冷CCD相機是分子影像成像分析系統的未來的發展趨勢和必須要求。 (1)、分辨率 分辨率的大小和像素值是分不開的,像素指得是CCD能分別的較為小的感光元件,我們平時說的多少萬像素就是這些感光元件的個數了。所以一般來講像素越多,成像也就越清晰細膩,當然這其中還要受許多因素限制,下面會慢慢提到的。但是高像素也不一定是好的CCD,其原因就是像素大小(Pixel Size),也是很重要的因素,相同數目的像素,排列越密集,像素之間就越容易出現電流干擾,容易出現"噪點"等干擾成像質量的現象出現。由于制造工藝的限制,增加尺寸,成本將會以幾何級數提高。 現在大部分廠家的CCD為了提高圖像的靈敏度,會使用像素合并的技術,那么像素合并的意義是什么呢? 像素合并是一種非常有用的功能,它可被用來提高像素的大小和靈敏度,如CCD分辨率為1392X1040,像素大小為6.45um,當經過2X2合并后,分辨率變成696X520,像素大小為12.9um.但經過4X4合并后,分辨率只有348X260,分辨率太小,在實際應用中就沒有太多意義了。 (2)、動態范圍值 動態范圍表示在一個圖像中較為亮與較為暗的比值。 灰階表示在一種表征光亮度的方法,12bit表示從較為暗到較為亮等分為2^12=4096個級別,16bit即為2^16=65536個級別,可見bit值越高能分出的細微差別越大. 12bit與16bit在圖像分辨上的區別 對動態范圍進行量化需要一個運算公式,即動態范圍值 = 20 log (well depth/read noise),其中Well depth代表是滿井電子,是CCD飽和時能接受的電子信號總值,read noise是讀出噪聲(以電子數來表示),每個CCD在讀數的過程中都會產生噪聲,噪聲越小,監測靈敏度越高。其中滿井電子與CCD的bit值是相關的,通常下,bit值越高,滿井電子的數值越大。 舉例如下: Well depth = 85,000 個電子, read noise = 12 個電子 Dynamic range = 20 log (85,000/12), or 77dB. 動態范圍的值越高CCD性能越好. (3)、量子效率 CCD的量子效率也稱像素靈敏度,指在一定的曝光量下,像素勢阱中所積累的電荷數與入射到像素表面上的光子數之比。不同結構的CCD其量子效率差異很大。比如100光子中積累到像素勢阱中的電荷數是50個,則量子效率為50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是CCD 的量子效率與入射光的波長有關。 (4)、信噪比 說到信噪比就不得不提到暗電流了, 暗電流是導致CCD噪音的很重要的因素。暗電流指在沒有曝光的情況下,在一定的時間內,CCD傳感器中像素產生的電荷。我們在做化學發光檢測的時候,需要的曝光的時候比較長,這樣導致CCD產生較多的暗電流,對圖像的質量影響非常大。通常情況下通過降低CCD的溫度來較為大限度的減少暗電流對成像的 影響。CCD產生的暗電流隨著溫度下降而減少,但是在-23℃下開始趨于平緩,由此可以得出溫度并非需要無休止的降低的。所以在選擇冷CCD時,溫度在-25℃(溫度,非室溫以下)下一般就可以達到您的要求了。 有的CCD是在圖像較為終生成后,通過軟件去背景來扣除暗電流,對于信號遠遠強于背景的有一定效果,但是對于弱信號處理過程中會產生越來越多的錯誤。 (5)、光學鏡頭 光學鏡頭是機器視覺系統中*的部件,直接影響成像質量的優劣,影響算法的實現和效果。光學鏡頭規格繁多,有時不免頭暈。光學鏡頭從焦距上可分為短焦鏡頭、中焦鏡頭,長焦鏡頭;從視場大小分有廣角、標準,遠攝鏡頭;結構上分有固定光圈定焦鏡頭,手動光圈定焦鏡頭,自動光圈定焦鏡頭,手動變焦鏡頭、自動變焦鏡頭,自動光圈電動變焦鏡頭,電動三可變(光圈、焦距、聚焦均可變)鏡頭等。 (6)濾光鏡片 熒光:EB 、TLC plates、GFP plates、SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Red、SYPRO Orange、Texas Red、Rhodamine Red、Fluorescein、Deep Purple、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、熒光板等 (要根據具體的激發光源和濾鏡來決定) 光源
| 激發波長 | 吸收波長 | 染料 | Blue | 475nm | 537nm | SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Orange、Cy2等 | Green | 534nm | 606nm | SYPRO Red、Cy3等 | Red | 632nm | 609nm | Texas Red、Rhodamine Red 、Cy5等 |
凝膠成像系統特點: - 暗箱模具成型,小巧美觀、抗干擾、密封性好!
- 專業化凝膠圖像分析軟件,全中文操作界面,自動識別8 bit、10bit、12 bit、16 bit圖像,友好的人機界面,操作簡便,功能強大,可對凝膠圖像進行采集、編輯、分析及管理
- 日本原裝高分辨率變焦光學鏡頭
- 安全實用的凝膠切割工作裝置
- 全電腦控制所有操作過程,高度程序化(電腦控制暗箱/紫外及白光/光圈/變焦/焦距)
- 定時關機:用戶可自行設定定時關閉紫外光源的時間
- 拍攝范圍:較為大成像面積21cm×26cm
- 光源:多個輔助光源包括紫外透照,白光透照,紫外反射,白光反射等
主要功能: 1.凝膠圖像剪輯處理,標記; 2.自動尋找凝膠條帶; 3.與公用的標準條帶或自選的標準條帶比較; 4.條帶(泳道)遷移路徑的校正; 5.核酸、蛋白的處理,計算相應的分子量等數值; 6.詳細的分析結果可輸出成EXCEL格式,根據需要編輯。 適用范圍: 從整體總的來說凝膠成像(系統)可應用于:蛋白質、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分離純化結果作定性分析 (1)分子量定量 對于一般常用的DNA膠片,利用分子量定量功能,通過對膠上DNA Marker條帶的已知分子量注釋,自動生成擬合曲線,并以它衡量得到未知條帶的分子量。通過這種方法所得到的結果較肉眼觀察估計要準確很多。 (2)密度定量 一般常用的測定DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)濃度的方法是紫外吸收法,但它只能測定樣品中的總核苷酸濃度,而不能區分各個長度片段的濃度。利用凝膠成像系統和軟件,先將DNA膠片上某一已知其DNA含量的標準條帶進行密度標定以后,可以方便的單擊其他未知條帶,根據與已知條帶的密度做比較,可以得到未知DNA的含量。此方法也適用于對PA GE蛋白膠條帶的濃度測定。 (3)密度掃描 在分子生物學和生物工程研究中,我們較為常用到的是對蛋白表達產物占整個菌體蛋白的百分含量的計算。傳統的方法就是利用的密度掃描,但利用生物分析軟件結合現在實驗室常規配備的掃描儀或者直接用白光照射的凝膠成像就能完成此項工作。 (4)PCR定量 PCR定量主要是指,如果PCR實驗擴增出來的條帶不是一條,那么可以利用軟件計算出各個條帶占總體條帶的相對百分數。就此功能而言,與密度掃描類似,但實際在原理上并不相同。PCR定量是對選定的幾條帶進行相對密度定量并計算其占總和的百分數,密度掃描時并對選擇區域生成縱向掃描曲線圖并積分。 凝膠成像的分類: (1)普通凝膠成像分析系統:可以對蛋白電泳凝膠,DNA凝膠樣品進行圖象采集并進行定性和定量分析,樣品包括:EB、SYBR Green、SYBR Gold、Texas Red、GelStar、Fluoroscecin、Radiant Red等染色的核酸監測;以及Coomassie Blue、SYPRO Orange、各種染色的蛋白質凝膠如考染等。(或UV,EB和有色及可見樣品成像); (2)化學發光成像分析系統:成像范圍涵蓋UV,EB,化學發光、紫外-熒光、有色及可見樣品成像; (3)多色熒光成像分析系統:成像范圍涵蓋UV,EB,化學發光、多色熒光熒光、有色及可見樣品成像; (4)多功能活體成像分析系統:UV,EB,化學發光、多色熒光熒光、有色及可見樣品成像和離體組織和小型動物,及大型型動物。 較為后是品牌推薦: 進口品牌美國的市場上見的是相對比較多的有:UVP、伯樂、alpha、SIM、KODAK、GE、Wealtec等;德國品牌主要有:Royal、Raytest等;英國品牌:UVI、Fedbio等;以色列DNR;荷蘭Isogen等等。目前這些國內進口品牌和國產品牌的市場差不多,但是價格肯定是高于國產品牌。 中國本土企業也掌握了凝膠成像核心技術,性能方面不比進口差,價格又比進口的低,本土的品牌大致上可見:北京六一、君意東方、上海領成、上海培清、上海山富、上海復日、上海嘉鵬、上海勤翔、江蘇捷達等品牌。
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